Establecida durante la colonia por la Corona española en el siglo XVII, aprobada por la Santa Sede y dirigida por las órdenes regulares de la Iglesia Católica. Tras la independencia de 1821 se llamó únicamente Universidad Pontificia.
El proceso de colonización implicó la creación de una sociedad, para lo cual se establecieron instituciones de gobierno civil y eclesiástico. Con el paso del tiempo, los vecinos de la ciudad exigieron un lugar en la burocracia de la corona para sus descendientes, como premio a las hazañas de conquista llevadas a cabo por sus antepasados. Sin embargo, no existían centros educativos para que los jóvenes obtuvieran los conocimientos necesarios para servir como ministros.
Fue hasta la segunda mitad del siglo XVI cuando aparecieron las primeras iniciativas para establecer estudios más allá del adoctrinamiento religioso y la alfabetización que acompañaba a ello. El primer obispo de Guatemala, Francisco Marroquín, solicitó aprobación real para fundar una cátedra de gramática, en ella se enseñaría latín, que era la lengua utilizada por la cultura letrada de la época. Este hecho ha sido el argumento más utilizado para perpetuar el mito fundacional que vincula directamente al primer obispo de Guatemala con los antecedentes de la Universidad de San Carlos.
Luego de iniciada la colonización se comenzaron a fundar las primeras universidades por órdenes Reales y Pontificias en diversos puntos del Nuevo Mundo.
Hacia el final de su vida, en 1562, Marroquín decidió dejar en su testamento un caudal para fundar un colegio, el de Santo Tomás de Aquino, en donde se impartieran cátedras de gramática, artes o filosofía y teología. Los beneficiarios de esta obra pía sería los hijos de españoles pobres, ya que éstos no podían trasladarse a ciudades donde había universidades reales, como México. La heredad del obispo ha sido interpretada también como el origen de la universidad. Sin embargo, el prelado tenía muy clara la diferencia entre un colegio -residencia de estudiantes, con o sin cátedras- y un a universidad o Estudio General, donde se otorgaban grados. Al respecto, el historiador John Tate Lanning afirma que: «Este testamento es tan bien conocido que algunos que ni siquiera lo han visto han leído en él muchas cosas que no están allí. En ninguna parte menciona Marroquín una universidad, mucho menos declara intención de establecer alguna. Lo que sí está documentado es que el alcalde Pedro Crespo Suárez al morir, donó veinte mil pesos para la institución de cátedras de la universidad «que se está gestionando.
En 1598, el tercer obispo de Guatemala fray Gómez Fernández de Córdoba y Santillán, O.S.H., siguiendo las directrices eclesiásticas del Concilio de Trento y apoyado por las reales cédulas que se emitieron tras dicho concilio, autorizó la fundación del Colegio y Seminario Tridentino de Nuestra Señora de la Asunción, el cual fue la primera institución de educación superior en el Reino de Guatemala. Por su parte, los jesuitas, quienes ya tenían el Colegio de San Borja y querían para sí el Colegio Tridentino se interpusieron a la fundación de ya que el colegio de Santó Tomás de Aquino, ya que no les parecía que las órdenes regulares de los mercedarios, franciscanos y dominicos o el cabildo catedralicio secular tomaran la iniciativa en cuestiones religiosas y educativas.
El presidente de la Audiencia autorizó el inicio de las lecturas, mientras se recibía la autorización para la construcción de un colegio para para los alumnos, pues sólo tenía un aula en un solar perteneciente al convento dominico donde, en teoría, debían leerse las cátedras de artes, teología y cánones. Después de varias décadas, alegatos y peticiones, el rey Carlos II expidió una real cédula, con fecha de 31 de enero de 1676, que dio licencia a la capital del Reino (situada entonces en la Antigua Guatemala) para fundar una universidad real o Estudio General, como también se les denominaba a este tipo de instituciones. Esta sería la tercera universidad real y pública de la América hispánica, y la segunda en la Nueva España (actual México). Después de un conflictivo proceso de organización, cinco años después de expedida la cédula real, la Universidad de San Carlos inició las lecciones de cinco de sus nueve cátedras, el 7 de enero de 1681, con más de sesenta estudiantes matriculados y siendo el Rector el Doctor José de Baños y Soto Mayor, arcediano de la Catedral, Predicador del Rey de España y Doctor de la Universidad de Osuna. La universidad fue inaugurada bajo el patrocionio de San Carlos Borromeo, dictando sus estatutos don Francisco Saraza y Arce, copia de los de México que, a su vez, eran adaptación de los de la Universidad de Salamanca en España.
Algunos de los catedráticos electos no tomaron posesión de sus sillas, debido a sus ocupaciones como procuradores y su pronta salida del reino, otros porque consideraron que su nueva categoría, como "interinos" y no como "propietarios" de la cátedra, no eran digna de su prestigio, y uno más, el catedrático de medicina, nunca llegó a Guatemala porque se encontraba en la Real Universidad de México leyendo otra cátedra.
La constitución universitaria exigía la libertad de cátedra, asimismo obligaba a que se leyesen doctrinas filosóficas contrarias para motivar la dialéctica y la discusión de ideas.
Las primeras cátedras de la Universidad de San Carlos fueron:
- Cánones
- Leyes
- Medicina
- Teología Escolástica
- Teología Moral
- Dos cursos de lenguas
La Real Universidad de San Carlos Borromeo recibió la aprobación papal por bula del 18 de junio de 1687, diez años después de su fundación y seis años después de que comenzaran las clases.
La admisión a la Universidad no era sencilla: estaban excluidos de ella los negros, los chinos, los morenos, los mulatos y los que hubieren sido penitenciados por el Santo Oficio o que ellos mismos hubieren incurrido en esa desgracia. Los aborígenes sí tenían derecho a matricularse y a obtener grados y consta que hubo entre ellos algunos que lucieron su talento en las materias que cursaron.
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